吉林大学自考本科现代生物制药技术复习资料 03748

发布日期:2014-06-16 点击次数:2701

名词解释
生物技术：又称为生物工程，是指人们以现代生命科学为基础，结合先进的工程技术手段利其他基础学科的科学原理，按照预先的设计改造生物体或加工生物原料，为人类生产出所需产品或达到某种目的的技术。
酶工程：是利用酶或细胞所具有的特异催化功能，或对酶进行修饰改造，井借助生物反应器器和艺过程来生产人类所需产品的一项技术。
蛋白质工程：是一门从改变基因入手，制造新的蛋白质的技术。
海洋生物技术：是指运用海洋生物学与工程学的原理和方法，利用海洋生物或生物代谢过程，生产有用物质或定向改良海洋生物遗传特性的高技术。
生物药物：是指运用微生物学、生物学、医学、化学、生物化学、生物技术、药学等科学的原理和方法，从生物体、生物组织、细胞、体液等制造的一类用于预防、治疗和诊断疾病的制品。
生物技术药物：是指采用DNA重组技术或其他生物技术生产的用于预防、治疗利诊断疾病的药物。
生物技术制药：是指利用基因工程、细胞工程、发酵工程、酶工程、蛋白质工程等生物技术，来研究、开发利生产用于预防、治疗利诊断疾病的药物。
基因工程制药：利用基因重组技术将外源基因导入宿主菌或细胞进行人规模培养，以获得蛋白质药物的过程称为基因工程制药。
载体：是携带外源目的基因或DNA进入宿主细胞，实现外源基因或DNA的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子，主要有质粒载休和λ噬菌体载体。
复制子：又称复制起始区，包含控制质粒DNA复制起点和质粒拷贝数等遗传因素。
报告载体：是指以易于检测的基因作为报告基因，通过报告基因的表达强度来研究外源调控因子的功能的一类载体。
鸟枪法：就是将生物体全部基因细通过酶切分成不同的DNA片段，与载体连接构建重组子，转化宿主细胞，从而形成含生物体全部基因组DNA片段的库。
cDNA文库法：是指提取生物体总mRNA，井以mRNA作为模扳，在逆转录酶催化下合成cDNA的一条链，再在DNA聚合酶的作用下合成双链cDNA，将全部DbIA都克隆至宿主细胞而构建成cDNA文库。
非融合蛋白：是指表达的外源蛋白的N-端不含任何大肠杆菌的多肽序列，即将外源基因5’-端直接位于翻译起始位点ATG之后。
融合蛋白：所谓融合蛋白是指将外源基因融合至某种特定原核结构基因下游，表达的外源蛋白N-端含原核多肽。
透析：是利用膜两侧的浓度差为驱动力，从溶液中分离出小分子物质的过程。
非贴壁依赖性细胞：这类细胞一般是来源于血液、淋巴组织的细胞和杂交瘤细胞。一些肿瘤细胞和某些生产干扰素的转化细胞都无需固体支持物即可在培养液中悬浮生长，因此也被称为悬浮细胞，细胞胞体—般呈圆球形。
兼性贴劈细胞：有些细胞对固体支持物的依赖性不严格，可以贴壁生长，但在—定条件下也可以悬浮生长，该类细胞称为兼性贴劈细胞。
细胞传代：将细胞从一个培养器皿中消化、分散并接种至另一个培养器皿中的操作称为细胞传代。
细胞克隆培养：即单细胞分离培养，是将动物组织分散后，将一个细胞从群体细胞中分离出来，由单个细胞培养成纯系细胞集群。
融合细胞系：是通过动物细胞融合技术而构建的。
平衡盐溶液：由生理盐水和葡萄糖组成，其中的无机离子是细胞的组成成分。
动物细胞培养：是指离散的动物活细胞在体外人工培养条件下生长、增殖的过程。
多抗：天然抗原分子中常含多种不同抗原特异性的抗原表位，以法抗原物质刺激机体免疫系统，休内多个B细胞丸降被澈活，产生的抗体中实际上含有针对多种不同抗原表位的抗体，是多克隆抗体，简称多抗。
抗原表位：又称抗原决定簇，指抗原分子种决定抗原特异的特殊化学基团。
细胞融合：是2个或2个以上的细胞个合并成一个细胞的过程。
超变区多肽：只含有一个CDR多肽的抗体称为超变区多肽，也称为最小识别单位。
细胞内抗体：亦称内抗体，主要是指细胞内合成并作用于细胞内组分的抗体。
抗体酶：抗体与酶蛋白的偶联物被称为抗体酶。
免疫毒素：抗体与毒素的偶联物被称为免疫毒素。
杂交瘤细胞克隆化：是指将刚性孔中分泌抗体的单个细胞分离出来。
抗体工程制药：是指利用基因工程、细胞工程(包括动物细胞工程和植物细胞工程)和转基因动物及转基因机物技术生产抗体药物的过程。
免疫黏附素：将具有Fc段与某些有黏附或结合功能的蛋白质融合而获得的融合蛋白称为Fc抗体融合蛋白，又被称为免疫黏附素。
噬菌体展示：将蛋白分子或肽段基因克隆到丝状噬苗体的基因组DNA中，并使噬菌体表面表达该异源性分子，这种方法称为噬菌体展示。
免疫原性：是指抗原能刺激机体特异性免疫细胞，使其活化、增殖、分化，最终产生免疫效应物质(抗体或致敏淋巴细胞)的特性。
免疫反应性：是指抗原与相应的免疫效应物质(抗体或致敏淋巴细胞)在体内或体外相遇时，可发生特异性结合而产生免疫反应的特性。
佐剂：是指能非特异性地增强免疫应答或改变免疫应答类别的物质，可先于抗原或与抗原一起注入机体。
亚单位疫苗：利用微生物的某种表面结构成分(抗原)制成、能诱发机体产生抗体+的疫苗，称为亚单位疫苗。
基因工程亚单位疫苗：是指在分离出病原体特异抗原编码基因的基础上，将外源基因转入另外一个通常是非致病性的微生物(如人肠杆菌或酵母)内表达基因产物，然后通过分离和纯化而获得特异的蛋白质。
联合免疫：是指将两种或两种以上的抗原采用联合疫苗、结合疫苗、混合或同次使用等方式进行免疫接种，以预防多种或不同血清刑的同种、以及不同生活周期传染病的—种子段。
联合疫苗：是由疫苗厂家将不同抗原进行物理混合后制成的一种混合制剂。
结合疫苗：与联合疫苗不同，是通过化学方法将两种或两种以上的抗原相互偶联而制成的疫苗。
酶工程：是酶学、微生物学的基本原理与化学工程等有机结合而产生的交叉学科。酶工程是利用酶或细胞所具有的特异催化功能，或对酶进行修饰改造，并借助生物反应器和工艺过程来生产人类所需产品的—项技术。其特是利用酶或含酶细胞作为生物催化剂完成重要的化学反应。
固定化酶：所谓固定化酶或固定化细胞，是将具有一定生理功能的酶或生物细胞，用物理或者化学方法将其固定，作为固体生物催化剂而加以利用的一种技术。
全酶：结合酶的蛋白质部分称为酶蛋白，非蛋白质部分称为辅助因子。只有酶蛋白与辅助因子两部分结合起来组成复合物才能显示催化活性，此复合物称为全酶。
辅酶：与酶蛋白结介得比较松弛，用透析法等可以将其与酶生白分开的则称为辅酶。
抽提：是将酶从生物组织或细胞破碎液中以溶解状态最大限度释放出来的过程，可根据目的酶的特点选用不同的溶剂进行抽提。
生物传感群：就是在酶和细胞固定化技术基础上发展起来的分析检测装置。
抗体酶：又称催化抗体，是一类免疫系统产生的、具有催化活性的抗体。
抗生素：是由微生物产生的在低浓度下具有抑制或杀死其他微生物作用的化学物质。
发酵工程：又称为微生物工程，是将微生物学、生物化学和化学工程学的基本原理有机地结合，利用微生物的特定性状，通过现代工程技术在生物反面器中生产工业原料与工业产品并提供服务的一种技术体系。
初级代谢产物：是菌体对数生长期产生的产物，如氨基酸、蛋白质、核甘酸、核酸、维生素、糖类等，这类代谢产物对菌体生长、分化和繁殖都是必需的，也是重要的医药产品。
次级代谢产物：一般在菌体生长的稳定期合成，与菌体生长繁殖无明显关系，具有较大的经济价值，如抗生素、生物碱、色素、酶的抑制剂、细胞毒素等。
微生物转化：利用这种微生物代谢过程中的某一种酶或酶系将—种化合物转化为含有特殊功能基团产物的生物化学反应称为微生物转化。包括脱氢反应、氧化反应(羟基化反应)、脱水反应、缩合反应、脱羧反应、氮化反应、脱氨反应、异构化反应等。
野生型菌株：直接从自然界中分离的菌株称为野生型菌株。
诱变育种：是利用物理或化学诱变剂处理均匀分散的微生物细胞群，促使其突变率大幅度提高，然后采用简便、快速和高效的筛选方法从中挑选出少数符合育种目的的突变株，以供生产实践或科学研究用。
种子扩大培养：是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩人培养，最终获得一定数量和质量的纯种的过程，这些纯种培养物称为种子。
二级发酵：只要通过—级种子罐生长即可按入发酵罐中，称为二级发酵。
连续发酵：是当发酵过程进行到一定阶段时(如产物合成时期)  —边连续补充发酵培养液，一边又以相同的流速放出发酵液，维持发酵液原来的体积的发酵方式，微生物在稳定状态下生长和代谢。
补料：当菌体在高浓度基质下其生长受到抑制，或发酵周期较长(5—10天)，产物的生物合成时间也较长，就需要在发酵过程中补加基质和前体，称为补料。
微生物转化：是微生物通过酶催化将—种物质(底物)转化成另一种物质(产物)的化学反应。
生物手性合成技术：是指利用酶促反应或特定的微生物转化技术将化学合成的外消旋体、前体或潜手性化合物转化成单一的光学活性的化合物(手性化合物)的技术。
蛋白质药物化学修饰：主要是指在分子水平上对蛋白质药物进行化学改造，通过对上链的切割、剪接及化学基团的引入，实现对蛋白质药物理化性质和生物活性的改变，属于蛋白质改性的范畴。
蛋白质的PEG修饰：即PEG化，是将活化的PEG通过化学方法以头价键偶联到蛋白质上的技术。
PEG定点修饰：是指选择蛋白质分子上特定位点的基团进行修饰。该修饰方法可避免或减少对活性位点的修饰，并且能较好地控制修饰程度，有利用产品质量控制和工业化生产。
核酸药物：与传统的核苷酸类药物不同，指的是那些只有特定碱基序列、可以在细胞中专一性地降低目标基因表达水平的寡聚核苷酸药物。
反义RNA分子：用与目标基因mRNA互补的一段寡聚核甘酸分子与目标mRNA配对结合，影响它的正常功能，这种寡聚核甘酸分子就是反义RNA分子。
反义核酸类药物：除了反义RNA，其他一些核酸分子也只有类似的抑制基因表达的作用。这些分子包括反义DNA分子，或由部分RNA利部分DNA形成的RNA-DNA嵌合分子，以及经高度化学修饰的寡聚核酸类似物。可以把这些分子统称为反义核酸类药物。
RNA干扰现象(RNAi)：是近年发现的一种由双链RNA诱导的基因表达调控利基因沉默的过程，其作用广泛存在于从植物、无脊椎动物到哺乳动物的各种生物。
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第一章  绪论
2．发酵工程这项技术主要包括菌种选育、菌种生产、代谢产物的发酵以及微生物功能的利用等技术。
7．生物药物制品包括生物体的初级利次级代谢产物，或生物体的某一组成部分，甚至整个生物体，主要有蛋门质、核酸、糖类、脂类等。
10、自从1982年第一个基因重组产品人胰岛素上市以来，美国己批准近100个生物技术药品上市，我国也有近50种产品上市。
12．1982年第一个生物技术药物——利用细菌生产的人胰岛素获得FDA批准升投放市场，它标志着现代生物技术医药产业的兴起。
重点难点
3、生物技术药物的特性。
生物技术药物的化学本质一般为通过现代生物技术制备的多肽、蛋白质、核酸及它
们的衍生物，与小分子化学药物相比，在理化性质、药理学与作用、生产制备和质量控制方面都有其特殊性。
 (1)理化性质特性
①相对分子质量大：生物技术药物的分子一般为多肽、蛋白质、核酸或它们的衍生物，相对分子质量在几千至几万，甚至几十万。
②结构复杂：蛋白质和核酸均为生物大分子，除一级结构外还有二、三级结构，有些由两个以上亚基组成的蛋白质还有四级结构。另外，具有糖基化修饰的糖蛋白类药物其结构就更为复杂，糖链的多少、长短及连接位置均影响糖蛋白类药物的活性。这些因素均决定了生物技术药物结构的复杂性。
③稳定性差：多肽、蛋白质类药物稳定性差，极易受温度、pH值、化学试剂、机械应力与超声波、空气氧化、表面吸附、光照等闲素的影响而变性火活。多肽、蛋白质、核酸类药物还易受蛋白酶或核酸酶的作用而发生降解。
 (2)药理学作用特性
①活性与作用机制明确：作为生物技术药物的多肽、蛋白质、核酸，是在医学、生物学、生物化学、遗传学等基础学科对正常与异常的生命现象研究过程中发现的生物活性物质或经过优化改造的这类物质，这些物质的活性和对生理功能的调节机制是比较清楚的。
比如在清楚地了解胰岛素在糖代谢中的作用以后开发出了具有降血糖作用的胰岛素；在大量的研究证明p53基因是抑癌基因以后将该基闪开发成了抗肿瘤药物。
②作用针对性强：作为生物技术药物的多肽、蛋门质、核酸在生物体内均参与特定的生理生化过程，有其特定的作用靶分子、靶细胞或靶器官。如多肽与蛋白质激素类药物是通过与它们的受体结合来发挥其作用的，单克隆抗体则与其特定的抗原结合，疫苗则刺激机体产生特异性抗体来发挥预防利治疗疾病的作剧。
③毒性低：生物技术药物本身是体内天然存在的物质或它们的衍生物，而不是体内原先不存在的物质，机体对该类物质具有相容性，并且这类药物在机体内被分解代谢后，其代谢产物还会被机体利用来合成其他物质，因此大多数生物技术药物在正常剂量情况一般不会产生毒性。
④体内半衰期短：多肽、蛋白质、核酸类药物可被体内相应的酶所阡解，对于分子质量较大的蛋白质还会遭到免疫系统的清除作用，因此生物技术药物一般体内半衰期均较短。如胸腺素α1在体内的半衰期为100min，超氧化物歧化酶的半衰期为6-10min，对于小肽其半衰期更短，如胸腺五肽只有不到lmin。
⑤有种属特异性：许多生物技术药物的药理活性与动物种属及组织特异性有关，如某些人源基因编码的多肽或蛋白质类药物，其与动物相应多肽或蛋白质的同源性较低，因此对一些动物无药理活性。
⑥可产生免疫原性：许多来源于人的生物技术药物在动物中有免疫原性，所以重复将这类药品给予动物将会产生抗体。有些人源性的蛋白质在人体中也能产生抗体，可能是重组蛋白质药物在结构上与人体天然蛋白质有所不同所致。
 (3)生产制备特性
①药物分子在原料中的含量低：生物技术药物一般由发酵工程菌或培养细胞来制备，发酵或培养液中所含欲分离的物质浓度很低，常常浓度低丁100mg／L。这样，就要求对原料进行高度浓缩，从而使成本增大。
②原料液中常存在降解目标产物的杂质：生物技术药物一般为多肽或蛋白质类物质，极易受原料液中一些杂质如酶的作用而发生降解。因此，要采取快速的分离纯化方法以除去影响目标产物稳定性的杂质。
③制备工艺条件温和：欲分离的药物分通常很不稳定，遇热、极端pH、有机溶剂会引起失活或分解。因此，分离纯化过程的操作条件一般较温和，以满足维持生物物质生物活性的要求。
④分离纯化困难：原料液中常存在与目标分子在结构、构成成分等理化性质上极其相似的分子及异构体，形成用常规方法难以分离的混合物。因此，需要用多种不同原理的层析单元操作才能达到药用纯度。
⑤产品易受有害物质污染：生物技术药物的分子及其所存在的环境物质均为营养物质，极易受到微生物的污染而产生一些有害杂质，如热原。另外，产品中还易残存具有免疫原性的物质。这些有害杂质必须在制备过程中完个去除。
 (4)质量控制特性
①质量标准内柞的特殊性：生物技术约物的质量标准包括基本要求、制造、检定等内容，而化学药物的质量标准则主要包括性状、鉴别、检查、含量测定等内容。
②制造项下的特殊规定：对于利用哺乳动物细胞生产的生物技术药物，在本项下要写出工程细胞的情况，包括：名称及来源，细胞库建立、传代及保存，主细胞库及工作细胞库细胞的检定：对于利用工程菌生产的生物技术药物，在本项下要写出工程菌菌种的情况，包括：名称及来源，种子批的建立，菌种检定。本项下还要写山原液和成品的制备方法。
③检定项下的特殊规定：在本项下规定了对原液、半成品利成品的检定内容与方法。原液检定项目包括生物学活性、蛋白质含量、比活性、纯度(两种方法)、分子量、外源性DNA残留量、鼠IgG残留量、宿主菌蛋白质残留量、残余抗生素活性、细菌内毒索检查、等电点、紫外光谱、肽图、N端氨基酸序列；半成品检定项日包括细曲内毒素检查、无菌检查；成品检定项目除一般相应成品药的检定项目外，还要检查生物学活性、残余抗生素活性、异常毒性等。
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第二章 基因工程制药
2．1989年，第一个基因工程药物干扰素批准上市；1992年，第一个基因工程乙肝疫苗投入市场。
6.在琼脂糖凝胶电泳中不同构型的同一质粒DNA虽有相同的相对分子质量(Mr)，却具有不同的迁移率，迁移速率大小为cccDNA>lDNA>ocDNA。
7．质粒具有遗传传递和遗传交换的能力；质粒具有不相容性。
10.最常见的选择标记为抗生素抗性基因，包括氨苄两林（Amp）、四环素（Tet）、氯霉素(Cm)卡那霉素（Kan）he 新霉索(Neo)等.
21.目前将重组DNA导入酵母的方法包括电转化法、化学转化法、原生质体转化法。
28目前常用的融合蛋白表达体系有谷胱甘肽S-转移酶（GST)表达体系、金黄色葡萄球菌蛋白A表达体系、麦芽糖结合蛋白MBP 表达体系等。
32．酵母表达系统包括酿酒酵母、裂殖酵母、克鲁维酸酵母、甲醇酵母等表达系统。
34.宿主菌不同、整合方式不同可获得三种营养表型：甲醇利用正表型（Mut+）甲醇利用慢表型(Muts)和甲醇利用负表型（Mut-）。
35.巴斯德毕赤酵母适宜的表达7度为300°C。
44．因此反渗透、超滤和微滤的相同点都是以压力著为驱动力；不同点是：反渗透只允许溶剂通过，可浓缩溶质或制备纯水；超滤可根据Mr的大小实现大分子物质的筛分，并可同时实现截留分子的浓缩；微滤只截留不溶性的颗粗。
46包涵体形式表达对蛋白质分离纯化有两方面的影响：积极的方面是比较容易与胞内可溶性蛋白杂质分离，使纯化较容易完成；消极的方面是包涵体需要经过复性才能拥有生物学活性。
51．人血清白蛋白是人血浆中含量最高的蛋白质（40g/L），由585个氨基酸残基组成，Mr为65kD。HSA具有维持血液渗透压、运输营养物质以及其他重要生物物质的作用。同时，HAS又是许多内源因子和外源药物的载体，药物和HSA结合以后，可以降低其生物利用度，并延长药物在体内的半衰期。
54．人血清白蛋白融合的重组蛋白类药物使蛋白类药物克服了半衰期短、清除率高的缺点，在保持原有药物活性的基础上，延长了蛋白质类药物的半衰期、降低了体内消除率，实现蛋白质类药物的长效治疗。
56.蛋白质纯度检测基因工程药物纯度检测的方法主要有：①SDS-PAGE法；②非变性PAGE法，3层析法等。
55基因工程药物质量控制项目主要有：蛋白质含量测定、纯度分析、蛋白性质测定、生物学效价测定、杂质分析等。
57．Mr测定方法主要有：①SDS-PAGE法；②层析法；③质谱法等。SDS-PAGE.层析法都只能粗略地测定蛋白质的Mr，而质谱法能够精确测定蛋白质的Mr。
58．蛋白质等电点测定一般采用等电聚焦凝胶电泳。
64．目前鉴定蛋白质纯度的方法常见的有电泳法、层析法、质谱法和末端氨基酸残基分析法等。
66．实验室常用蛋白质Mr的测定方法是SDS-PAGE法，它是在SDS存在下，蛋白质表面带有大堆负电荷，在这种情况下电泳，蛋白质移动的速度只与Mr大小有关，而与蛋白质本身的电荷无关。目前最为常用、最为准确的测定蛋白质Mr的方法是质谱法。
83.目前重组人胰岛素的生产中应用的主要有两种宿主表达系统：大肠杆菌表达系统和酵母表达系统。
91．hGH普遍存在于各种组织内，尤其是肝脏组织，是一个多靶点的重要生物分子。其分泌受生长激素释放激素( GHRH)和生长激素抑制素的调控，呈脉冲式释放。
92．临床上hGH主要用于治疗由于脑垂体生长素分泌不足而导致的垂体性侏懦症，除此之外还可用于烧伤、骨折、创伤、出血性溃疡、组织坏死、肌肉萎缩及骨质疏松等疾病的辅助治疗。
93. hGH是由191个氨基酸残基组成的单链球形酸性蛋白，等电点为52，Mr约为21.7kD,在55～165和182—189氨基酸残基之间具有两对链内二硫键，不舍糖基，其在体内1O%以变异体形式存在（Mr为20kD），缺失32—46这一段氨基酸残基序列。
重点及难点
3、影响目的基因与载体之间连接效率的主要因素：
  (l) DNA片段之问的连接方式：黏性末端的连接效率高于平头末端。
  (2)目的基因与载体的浓度和比例：增加DNA浓度可以提高连接效率，目的基因与载体DNA的摩尔数比应大于1。
  (3) 连接温度、时间、连接酶的活性及缓冲体系。
相对于连接效率，重组效率能更准确地反映DNA分子体外重组的效率。重组效率是指连接体系中成功构建的重组分子数与载体分子总数之比。
提高重组效率方法有：
  (1)提高目的基因DNA片段与载体DNA分子数之比，降低载体自身环化的概率；
  (2)在连接反应前，用碱性磷酸单酯酶催化戴体DNA去除5’一磷酸基团或用末端脱氧核苷酰转移酶（TDT酶）在载体DNA的3’一羟基聚合寡聚核苷酸以防止载体DNA自身及载体DNA之间的环化。
5、电穿孔法基本步骤如下：酵母细胞用山梨醇处理制备感受态细胞，将线性化DNA、感受态细胞置于电转仪中，通过电击将重组DNA导入酵母，电击后加入山梨醇，28—30℃培养2～3天，直至单菌落的出现。
7、重组DNA导入哺乳动物细胞的方法
(1)显微注射法：在显微镜下，用玻璃毛细管携带DNA注射入细胞核中，导入外源DNA的受精卵经体外培养以及分了生物学检测，然后进行胚胎移植。
(2)电穿孔法：电穿孔法指将哺乳动物细胞在高压电脉冲作用下，产生瞬时可逆性穿孔和吞噬作心摄取目的基因DNA。
(3) DNA磷酸钙转染法：含有目的基因DNA的氯化钙溶液与含有哺乳动物细胞的磷酸盐缓冲溶液混合，目的基因DNA与磷酸钙形成白色沉淀复合物黏附丁细胞膜表面，并被哺乳动物细胞捕获进入细胞内。
(4) DEAE-葡聚糖转染法：目的基因DNA经多聚阳离子试剂DEAE介导，被导入哺乳动物细胞。
(5)阳性脂质体介导的基因转染：以阳性脂质体为运载载体，介导目的基因DNA被哺乳动物细胞吞噬。
(6)细胞融合法：携带目的基因DNA的供体细胞和受体细胞经PEG或仙台病毒等处理发生融合，目的基因DNA转移至受体细胞。
(7)病毒感染法：携带目的基因DNA的病毒经外壳包装后成为成熟的病毒颗粒，感染哺乳动物细胞，将目的基因DNA整合至受件细胞染色体DNA上。
8、载体遗传标记法。
(1)抗生素抗性筛选法：抗生素抗性基因是最常见的筛选标记，包括Amp、Tet、Cm、Kan、Neo等。含有转化子被赋予拈抗抗生素的表型的重组子能在含抗生素的环境中生长，从而达到被鉴定筛选的目的。
(2)互补筛选法：重组子转化宿主细胞，载体的表达产物与宿主细胞中营养缺陷型突变发生互补作用，从而实现重组子的筛选。最常见的为蓝白斑筛选。如pUC载体及其衍生质粒含有lacZa基因，该基因编码入肠杆菌β一半乳糖苷酶α氨基端的α互补肽段，与宿主细胞编码的缺陷轻型p一半乳糖苷酶α实现互补。在异丙基-p-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导下，含有该类载体的宿主细胞的两个互补肽段产生活性，可分解培养基上的底物5一溴-4-氯一3 -吲哚-p-D-半乳糖茁(X-gal)，形成蓝色菌落。当外源基因插入lacZa基因内部的多克隆位点，X-gal的培养基的重组子由于IacZa基因的插入失活而呈白色．而含有空载体的宿主细胞显蓝色，从而达到被鉴定筛选的目的。
(3)营养缺陷型筛选法：载体携带某些营养成分（如某种氨基酸）的编码基因，而宿主细胞因该基因突变而不能合成该生长所必需的营养物质。因此只有含转化子的菌落才能够在缺少该营养物质的培养板上生长，从而实现筛选。
(4)噬菌斑筛选法：经噬菌体载体包装的外源重组DNA转染宿主细胞，转化子在固体培养板上出现清晰的噬菌斑，不含外源DNA的空载体因长度过小不能装配成噬菌体颗粒不能感染宿主细胞形成噬菌斑，从而实现筛选的目的。
10、巴斯德毕亦酵母表达系统相对于大肠杆菌表达系统的主要优点：
(1)高表达量，外源蛋白在毕赤酵母中可获得g/L表达量水平以上；
(2)高稳定性，外源基因被整合至毕赤酵母染色体上，随之复制和遗传，避免了丢失现象；
(3)翻译后修饰功能，包括信号肽的加工、蛋白质折叠、二硫键的形成和O-及N-糖基化、脂类添加等：
(4)分泌表达:培养基中含毕赤酵母自身蛋白较少，主要为分泌表达的外源蛋白，因此，有利于后续的分离纯化。
14、基因重组蛋白的主要分离技技术。
(1)离心 离心分离的原理是存转子高速转动所产生的离心力的驱动下，利用固体及液体间的密度差进行分离。离心是实现固液分离的重要手段。由于细胞、细胞碎片、包涵体和病毒颗粒的密度都大于环境液体的密度，可以用离心机将其分离。
(2)沉淀沉淀的原理是利用蛋白质在不同条件下的溶解度不同，通过某些方法降低某一蛋白质的溶解度，使它们在短时间内（儿分钟到儿小时）形成蛋白质聚集体，再用离心方法将其与溶液中其他蛋白质分离开来。
①等电点沉淀法  蛋白质是两性电解质，其带电特性与溶液的pH值有关。当溶液的pH在某一蛋白质的等电点(pl)时，该蛋白质所带净电荷为零，蛋白质分子便利相互作用、凝聚并沉淀。故可以利用这一性质来富集只有某一等电点的蛋白质组分，使其与其他的蛋白质组分分离。
②盐析法在高盐浓度时，蛋白质的溶解度会明显地随着溶液中盐离，浓度的增加而降低。增加溶液中的盐的浓度，盐离子会与蛋白质竞争与水的作用，从而使蛋白质失去分子表而水化膜阻隔作用，蛋白质被此靠近和作用的机会增加：高盐还能促进篮白质表面疏水区的相互作用。这两个因素均能促进蛋白质聚集而沉淀。
(3)膜分离  膜分高技术是指用半透膜作为选择性障碍层，使溶液中某些组分通过，而截留其他组分的分离方法。几种主要的膜分离技术如下：
①透析：透析是利用膜两侧的浓度差为驱动力，从溶液中分离出小分子物质的过程。在选择透析袋时，应注意袋的直径和纤维膜孔的标称孔径。
②反渗透、超滤和微滤：反渗透是通过外加的高于溶液渗透压的压力，使溶液中的水透过膜，而溶液中的溶质则全部被截留，从而使溶液进一步浓缩。超滤与反渗透并无原则的区别，只是超滤使用的孔径较大的薄膜，截留的Mr也较大。微滤则是以多孔细小的薄膜为过滤介质，使不溶物浓缩过滤的操作。
③电渗析：电渗析是在电位差的驱动下，用离子交换膜从溶液中分离离子的过程。其原理是用阴、阳离子交换膜交替排列在正负极之间，由此形成了许多独立的小单元。
(3)双水相萃取  双水相萃取的原理是水相中加入溶于水的高分子化台物如聚乙二醇和葡萄糖，形成密度不同的两相体系。由于两相中均含有较多的水，故称为双水相。
16.基因重组蛩白的主要纯化技术：
基因重组蛋白的纯化主采用层析法。
(1)离子交换层析  离子交换层析是最常用的层折方法之一，它是利用蛋白质等电点的差异来实现不同蛋白质问的分离和纯化。离子交换层析的基本原理是通过带点的溶质分子与离子交换剂中可以交换的离子进行交换，从而实现分离纯化。
(2)亲和层析  亲和层析是利用固定化配基与目的蛋白之间特异的生物亲和力进行吸附。这些相互作用包括酶与激活剂、抑制剂、底物之间的诱导契合，抗原与抗体之间的特异性结合，激素或配体与受体之间的相互作用，以及蛋白质与DNA, RNA上某些特定区域之间的相互作用等。由于分子之问相互作用的特异性和专一性，用亲和层析技术进行分离能使人多数目的蛋白在经过一次亲和柱往之后就达到很高的纯度。在亲和层析中起可逆结合的特异性物质称为配基，与配基结合的支撑物称为载体。
  (3)凝胶过滤层析  凝胶过滤层析又称为分子筛层析，也称排阻层析，其基本原理是根据生物大分子的Mr的大小来实现目的蛋白的分离纯化。
  影响凝胶过滤分离效果的因素有很多，主要有凝胶类型、柱塔扳数、上样量及流速等。对于分离不同Mr范围的样品，要采用不同类型的凝胶介质。
  凝胶过滤法具有许多优点：①分离蛋白质的Mr范围广，在儿百到几百万之间：②凝胶是不带电荷的惰性基质，不会与溶质分子发生任何作用，因此蛋白质的回收率高，试验的重复性好：③凝胶介质可反复使用。
(4)反相层析利疏水层析  反相层析和疏水相互作用层析是根据蛋白质疏水性的差异来实现分离纯化的。反相层析是利用溶质分子中非极性基团与非极性特定相之问相互作用力的大小，以及溶质分了中极性基团与流动相中极性分子之间在相反方向作用力的大小的差异进行分离的。
  反相层析和疏水层析的差异在于前者在有机相中进行，蛋白质经过反相流动相与固定相作用有时会发生部分变性，而后者通常在水溶液中进行，蛋白质在分离过程中一般仍保持其天然构象。
17、亲和层析主要包括下列5个步骤：
(1)配基固定化：选择合适的配基和不溶性的载体结合成具有特异性的分离介质。
(2)亲和吸附：配基与目的蛋白发生特异性结合，其他杂质分了大部分直接透过层析柱，但仍有少部分杂质分子能与配体发生非特异性的结合。
(3)洗涤：用足够最的平衡缓冲液洗涤柱子，以去除非特异性结台的杂质分子。
(4)洗脱解离：通过在流动相中加入与配基竞争结合的小分子物质、改变离子强度或改变pH值等，使目的蛋白与配基解离。
(5)再生：用大量的平衡缓冲液清洗层析柱，使亲和层析凝胶恢复到原来的状态。某些凝胶再生时，如金属离子蝥合层析剂，还需加入一定量的配体分子用以补偿在层析过程中丢失的金属离子。
18、一般来说，分离纯化工艺应遵循以下原则：
(1)具有良好的稳定性、重复性和较高的安全性：工艺的稳定性包括不受或少受发酵工艺、条件及原材料来源的影响，存任何环境下使用都应具有重复性，可生产出同一规格的产品。
(2)尽可能减少组成工艺的步骤：步骤越多，产品的后处理收率越低，但必须保证产品的质量。
(3)分离纯化工艺所用的时间要尽可能短：因稳定性差的产物随工艺时间的增加，收率特别是生物活性收率会降低，产物质量也会下降。
(4)工艺和技术必须高效：所采用的工艺利技术应尽可能地做到收率高、易操作、对设备要求低、能耗低。
24、生产胰岛素的过程中，以大肠杆菌、酵母菌作为宿主的表达系统的优缺点。
(1)以大肠杆菌作为宿主的表达系统有两个优点：一是表达量高，一般表达产物可以达到大肠杆菌总蛋白的20%一30%：二是表达产产物为不溶解的包涵体，经水洗后表达产物的纯度可以达到90%左右，易于分离纯化。
缺点是表达出的胰岛素无生物活性，需要经过复性才能显示其生物活性。
(2)以酵母菌作为宿主的表达系统也具有两个优点：一是表达产物的二硫键结构位置都是正确的，二是不需要复性加工处理。
缺点是表达量低、发酵时间长。
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第三章  动物细胞工程制药
2.1957年，Dulbecc。实验室采用胰蛋白酶消化处理，使成块的组织分散成单个细胞，并用液体培养的方法获得了单层细胞，从而开创了真正意义上的动物细胞培养技术。
6．根据体外培养时动物细胞对生长基质的依赖性，可将动物细胞分为贴壁依赖性细胞、非贴壁依赖性细胞利兼性贴壁细胞三种类型。
9．细胞深低温保存的基本原理是：在-70℃以下时，细胞内的酶活性均已停止，即代谢处于完全停止状态，故可以长期保存。 
10．细胞低温保存的关键在于：通过0～20℃阶段的处理过程。 
11．细胞复苏的原则是快速融化，必须将冻存在—196℃液氮中的细胞快速融化至37℃，使细胞外冻存时的冰品迅速融化，避免冰品缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。 
12．动机物及微生物细胞培养时，所需营养成分大都包括水、碳源、氮源、
15．合成培养基的化学成分主要为氨基酸、碳水化合物、蛋白质、核酸类物质、维生索、辅酶、激素、生长阴子、微量元素及缓冲剂等。
17．人们经过研究发现，只要在培养基中增加某些适于细胞生长的成分，如纤连蛋白、转铁蛋白、胰岛素、表皮生长因子等。
22．常用消化液有胰蛋白酶溶液、EDTA溶液。
23．EDTA为一种化学整合剂，其溶液义称Versen液，对细胞具一定的非酶性解离作用。
27．一般1g组织中约有109个细胞。
29．二倍体细胞系—般从动物胚胎组织中获取，有明显的贴蹬利接触抑制特性，有正常细胞的核型，一般可传代培养50代，且无致瘤性。
32．基因工程细胞系的构建人致包括表达载体的构建、表达载体的导入以及表达细胞株的筛选等过程。
41．一般来说，融合细胞的构建主要包括细胞融合和细胞筛选两个过程。
56．人EPO有2个等位基因。
 62．利用动物细胞培养制造促红细胞生成素的工艺条件；有搅拌速度、温度、pH值、氧、葡萄糖等。
    重点及难点
1、动物细胞培养的环境条件。
  除了营养要求以外，动物细胞的培养对环境条件非常敏感，所以对这些条件必须严格控制，pH值、通氧量、渗透压等。
 (1)培养温度  不同种类的动物细胞对温度的要求不完全一致，如哺乳类动物细胞的最适培养温度是37°C，昆虫细胞则为25～28°C。
 (2)pH值  大多数动物细胞适合在pH 7．2—7．4生长。细胞生长越旺盛，代谢越活跃，培养液中的pH值改变越迅速。当pH值低于6．8和高于7．6时，对细胞生长不利，甚至会引起细胞死亡。
 (3)通氧量  动物细胞培养时对氧气的要求与微生物是不一样的，在培养中要使用C02 培养箱，通入一定的C02，这是因为动物细胞在体内生长的环境是含有CO2的。不同的细胞对氧和C02的比例要求不一样。
 (4)防止污染  防止污染是动物细胞培养中十分重要的问题。由于动物细胞生长的时间长，培养液的营养义十分丰富，细菌、真菌、病毒、生物组织材料、操作者自身、培养基、各种器皿以及环境均可引起污染。特别是小牛血清的支原体污染及组织材料的污染问题更为棘手。显著污染的标志是培养是的pH值迅速改变，细胞外形模糊，甚至出现漂浮的细胞集落。为了避免污染，所有的培养液利器皿等都要按操作规程严格灭菌，并且在配制培养液时往往要加入各种抗生素。常用的是青霉素、链霉素和卡那霉素等。
 (5)基本营养物质  能进入细胞中被细胞利用利参与细胞代谢活动的物质属营养物质，体外培养细胞所需营养物质与休内基本相同。除三大营养素外，也需要一定量的维生素等。这些营养物质由动物细胞培养基提供。此外，还需要激素类物质和促细胞生长因子。
 (6)渗透压  大多数培养细胞对渗透压有一定耐受性。不同细胞可能有所不同：鼠细胞渗透压在320mOsm／L左右，对人多数细胞来说，渗透压力：260～320mOsm／L范围都适宜。
4、细胞冻存中的注意事项：
(1)冻存的细胞应在对数生长期且存活率高的状态；
(2)冻存的细胞应处在良好的营养状态，故在冻存前一天要换液培养：
(3)细胞密度以1X106~2X106个／mL为好
(4)配制冻存用培养基要与实际使用的一致，另加保护剂二甲基亚砜或10％甘油，二甲基亚砜除菌过滤，不要用高压蒸汽灭菌：甘油以高压蒸汽灭菌后避光保存。在开启后一年内使用，又长期储存后对细胞会有毒性；
(5)细胞冻存管封口后要检查其密封性。再者，细胞冻存管的标签上要标注细胞名称、编号利冻存日期。
6、动物细胞营养要求的特点为：
 (1)碳源不能为无机物，大多为葡萄糖：
 (2)氮源亦不能为无机物，主要为各种氨基酸：
  (3)在很多情况下尚需添加5％一20％的小牛血清或适量的动物胚胎没出液。
9、连续式操作的优缺点：
  连续式操作的优点为：(1)细胞维持持续指数增长；(2)产物体积不断增长：(3)可控制衰退期与下降期。
  连续式操作缺点为：(1)由于是开放式操作，加上培养周期较长，容易造成污染；(2)在长周期的连续培养中，细胞的生长特性以及分泌产物容易变异：(3)对设备、仪器的控制技术要求较高。
10、细胞融合全过程中会发生帕0主要变化：
  呈致密状态的体细胞在促融剂的作用下细胞膜的性质发生变化，首先出现细胞凝集现象，然后一部分凝集细胞之间的膜发生粘连，继而融合成为多核细胞，在培养过程中多核细胞又进行核的融合而成为单核的杂种细胞；而那些不能形成单核的融合细胞在培养过程中逐渐死亡。
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     第四章  抗体工程制药
2．多抗的优势是：作用全面，只有中和抗原、免疫调理、激活补体系统、抗体依赖细胞介导的细胞毒(ADCC)等重要作用，来源广泛，制备容易。
4.多抗被用于预防或治疗感染性疾病，例如乙刑肝炎病毒、呼吸道合胞病毒、巨细胞病毒和狂犬病毒引起的感染，还用于破伤风杆菌、肉毒毒素中毒的治疗。
6.单抗改造的主要目的是降低或去除鼠抗体的成分，用人抗体的相应成分取代。
13.单抗的制备过程人体分为抗原的制备、动物的免疫、B细胞与骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞、筛选杂交瘤细胞、筛选能产生某种特异性单抗的杂交瘤细胞、杂交瘤细胞的克隆化、体外大规模培养或动物腹腔培养特异性杂交瘤细胞克隆、单抗的纯化及鉴定。
16．免疫接种是单抗制备过程种的重要环节之一，其目的在于使B细胞在特异抗原刺激下分化、增殖、分泌特异性抗体。
22．抗原的乳化程度对免疫效果有较大的影响，常用的检测方法是将形成的油包水乳浊液。
28．免疫脾细胞指的是处于免疫状态脾脏中的B淋巴母细胞。
23.体内免疫采用皮下注射、腹肺或静脉注射，也可采用足垫、皮内、淌鼻或点眼等。
35．细胞融合的操作方法很多，常用的有转动法利离心法。融合时脾细胞利骨髓瘤细胞的比例为l:1～10:1不等，一般3:1～5:1最为常用。
39．细胞冻存液：50％小牛血清，40％不完全培养液和10％DMSO(二甲亚砜)。
49．Fab抗体片段由重链V区及CHI功能区与整个轻链以二硫键形式连接而成，主要发挥抗体的抗原结合功能。
50．Fv抗体片段是由一个VH和一个VL组成的。VH和VL通过非共价键结合组成，是抗体中具有完整抗原结合活性的最小功能片段，分子量只有完整抗体的1／6。
52．ScFv的制备常采用基因工程技术，主要步骤包括ScFv的基因构建和重组ScFv的表达。
54．制备ScFv的关键是得到可变区基因，引物的设计非常重要，因此可以根据FR—1和FR-4的碱基组成利顺序分别合成用于扩增VH和VL基因的PCR引物。
68．CDR是构成抗原抗体结合的最小结构单位。
70．细胞内抗体的主要应用为：①分子功能的研究：②下调细胞因子受体的表达；⑧抑制细胞内癌蛋白的活性；④抑制病毒复制。
73．噬菌体抗体库的筛选包括两个主要步骤：淘筛利鉴定。
75．全球有7种治疗性全人单克隆抗体获得了美国FDA和欧盟的批准，其中美国FDA批准6种。美国FDA批准的第一种人单抗为阿达木单抗(2002年)，第二种为帕尼单抗(2006年)，另4种于2009年批准。这些全人抗体几乎完全由转基因小鼠产生(美国FDA批准的6种全人单抗中的5种)，其中1种由转基因小鼠XenoMouse 技术生产，4种由转基闪鼠U1tiMab平台制备。
76．1986年，美国FDA批准上市了第一个用于治疗移植物抗宿主病的抗体药物rthocloneOKT3，翻开了生物医约史上崭新的—页。
  重点及难点
5、单克隆抗体技术的原理：
  单克隆抗体技术的原理是基于动物细胞融合技术得以实现的，即骨髓瘤细胞与B细胞的融合。骨髓瘤细胞(一种肿瘤细胞)在体外培养能人量无限增殖，但不能分泌特异性抗体：而抗原免疫的B细胞能产生特异性抗体，但在体外不能无限增殖。将免疫B细胞与骨髓瘤细胞融合后形成的杂交瘤细胞，继承了两个亲代细胞的特性，既只有骨髓瘤细胞能无限制增殖的特性，又具有免疫B细胞合成和分泌特异性抗体的能力。
6、抗原的制备。
  要制备特定抗原的单克隆抗体，首先要制备用于免疫的适当抗原，再用抗原进行动物免疫。目前常用下列方法获得抗原。
 (1)用基因工程技术制备重组蛋门抗原
  由于天然蛋白含量很低，而且天然生物材料也非常难得，因此为获得足够数量的蛋白抗原，常采用基因工程的方法制备重组蛋白抗原。但是通过原核表达系统获得的重组蛋白，只能解决连续氨基酸表位和部分抗原构象表位的抗原来源问题，只能满足部分抗原的需要。而真核及哺乳动物细胞重组表达系统则可以解决抗原构象表位的问题，是抗原的最佳来源。但表达量偏低，成本过高，因此没有广泛使用。
 (2)提取纯化天然抗原
  运用蛋白质等生物大分子分离纯化技术直接从生物标本中分离纯化蛋白质分子用作抗原，即天然抗原，包括天然的蛋白质抗原利颗粒性的细胞抗原(如肿瘤细胞、细菌等)。
 (3)合成多肽半抗原
  根据抗原蛋白的氨基酸序列，借助抗原表位预测分析软什，也能比较准确地预测和筛选出抗原性较好的多肽片段，经人工固相合成，最终获得抗原表位的多肽片段，即多肽半抗原。
 (4)小分子半抗原
  抗生素、食品添加刑、农药、兽药、重金属等大多属于小分子半抗原，没有免疫原性，必须与载体交联成人工合成抗原(完全抗原)才能获得免疫原性。
 (5)多肽半抗原及小分子半抗原与载体偶联
抗原分子都具有抗原性和免疫原性两种特性。多肽和小分子化合物等通常只具有抗原性而不只有免疫原性，必须运用蛋白质修饰或生物标记技术与载休蛋白分子匙孔血蓝蛋白(KLH)或牛血清洁蛋白(BSA)偶联，才能获得免疫原性，成为完全抗原用于动物的免疫。常用的交联方法有碳二亚胺法、戊二醛法、活性酯法、混合酸酐法、重氮化法、同型或异型双功能交联剂法等。
7、克隆化的原则。
  对于检测抗体阳性的杂交克隆应尽早进行克隆化，否则分泌抗体的细胞会被非分泌抗体的细胞所抑制，因为非分泌抗体的细胞生长速度比分泌抗体的细胞生长速度快，两者竞争的结果会使分泌抗体的细胞丢失尖。即使克隆化过的杂交瘤细胞也需要定期再克隆，防比杂交瘤细胞的突变或染色体丢失，从而丧失产生抗体的能力。
9、单克隆抗体的鉴定。
 (1)抗体特异性的鉴定
  除用抗原进行抗体的检测外，还应该用与其抗原成分相关的其他抗原进行交义实验进行抗体特异性的鉴定，方法可选择用ELISA和IFA法。
 (2)单抗的抗体类与亚类的鉴定
  由于不同类和亚类的抗体在生物学功能上可有较大差异，诸如激活补体系统、凋理作用、ADCC作用等，因此要对单抗进行类和亚类的鉴定。目前，常用的方法是ELISA法。
 (3)单抗中利活性的鉴定
  用动物的或细胞的保护实验来确定单抗的中和活性，即生物学活性。
 (4)单抗识别抗原表位的鉴定
  用竞争结合实验、测相加指数的方法，测定单抗所识别的抗原位点，来确定单抗识别的表位是否相同。
 (5)单抗亲利力的鉴定
  抗体的亲和力是指抗体和抗原结合的牢固程度。抗体亲和力的测定对抗体的筛选、确定抗体的用途、验证抗体的均一性符只有重要意义。亲和力的高低是由抗原分子的大小、抗体分子的结合位点与抗原表位之间立体构型的合适度决定的。只有当抗原与抗体结合部位结构完全吻合时，抗体的亲和力最大。这种结合力以抗原抗体反应平衡时抗原与抗体浓度的乘积与抗原抗体复合物浓度之比表示。一般用ELISA或RIA竞争结合实验来确定单抗与相应抗原结合的亲和力。
 (6)抗体效价测定
  效价(也称滴度)以小鼠KU腔积液或细胞培养液的稀释度表示，稀释度越高，则抗体效价也越高。在ELISA中，腹腔积液效价可达100万以上。如ELISA效价低于10万，用于诊断测定将不会达到很高的敏感度，应重新制备。
13、细胞融合的影响因素、失败原因分析：
  细胞融合失败的主要类别有污染、融合后杂交瘤不生长、杂交瘤细胞不分泌抗体或停止分泌抗体、杂交瘤细胞难以克隆化。
 (1)污染
  包括细菌、霉菌和支原体的污染，这是杂交瘤工作中最棘手的问题。一旦发现有霉菌污染就应及早将污染板放弃之，以免污染整个培养环境。支原体的污染主要来源于牛血清。
  此外，其他添加剂、实验室工作人员及环境也可能造成支原体污染。在有条件的实验室，要对每一批小牛血清和长期传代培养的细胞系进行支原体的检验，弃出污染源应及时采取措施处理。对于污染的杂交瘤细胞可以采取生物学的过滤方法，将污染的杂交瘤细胞注射rBalb／c小鼠的腹腔，待长出胶水或实体瘤时，无菌取出分离杂交瘤细胞，一般可除去支原体污染。
 (2)融合后杂交瘤不生长
  在保证融合技术没有问题的前提下，主要考虑的因素有：  ①PEG有毒性或作用间过长：②牛血清的质量太差，用前没有进行严格的筛选；③骨髓瘤细胞污染了支原体；④HAT有问题，主要是A含量过高或HT含量不足。
 (3)杂交瘤细胞不分泌抗体或停止分泌抗体
  ①融合后细胞生长，但无抗体产生，可能是HAT中A失效或骨髓瘤细胞发生突变，变成A抵抗细胞所致；②有可能是抗原免疫性弱，免疫效果不好；③原分泌抗体的杂交瘤细胞变为阴性，可能是细胞支原体污染，或非抗体分泌细胞克隆竞争性生长，从而抑制了抗体分泌细胞的生长。也可能发生染色体丢失。
  Goding(1982)曾提出“三要”、“三不要”，可能是防止抗体停止分泌的有效措施。
  “三要”：要大量保持和补充液氮冻存的细胞原管；要应用倒置显微镜经常检查细胞的生长状况：要定期进行再克隆。
  “三不要”：不要让细胞过度生长”，因为非分泌的杂交瘤细胞将成为优势，压倒分泌抗体的杂交瘤细胞：不要让培养物不加检查地任其连续培养儿周或儿个月：不要不经克隆化而使杂交瘤在机体内以肿痛生长形式连续传好儿代。
 (4)杂交瘤细胞难以克隆化
  可能与小牛血清质量、杂交瘤细胞的活性状态有关，或由于细胞有支原体污染使克隆化难以成功。若是融合后的早期克隆化，应在培养液中加FIT。
15、ScFv具有自身的一系列特点：
①只含有抗体的v区，却能保持较完粘的抗原结合位点；
②缺乏Fe段，不与非靶细胞(Fc受体刚性细胞)结合，有利于作为药物的导向载体，临床应用于定位成像检查时，能使图像更清晰：
⑧免疫原性低；
④分子量小，容易穿透血管壁、组织及实体瘤；
⑤体内血循环半衰期短，易从血循环中排除：
⑥在其基因的3端连接适当的目的分子，如：酶、毒素、药物等可构建成双功能抗体：
⑦能直接与肿瘤细胞、病毒表面上的抗原结合；
⑧由于分子量小，在大肠杆菌中的表达优于完整抗体；
⑨因只能与抗原结合，不能激活补体介导细胞免疫及ADCC：
⑩由于是单价抗体，仅有一个抗原结合位点，其亲利力利稳定性较单抗低。
18、以双特异单链抗体制备为例，说明bsAb的制备方法。
  该制备方法的核心是将两条ScFv以一定方式连接起来，并使其各自保留与特异性抗原结合的能力。按双特异单链抗体分子连接方式的不同，可将其制备途径归为3类：
 (1)非共价键制备双特异抗体。其方法是用一短的氨基酸linker  (3～15氨基酸残基)将一抗体的重链(VHA)与另一抗体的轻链(VLB)连接起来，构成杂合ScFv，同样再以VLA和VHB构建杂合ScFv，两条杂合ScFv在同一表达系统，同时分别表达，由于短的linker的限制，同一条肽链内的两个V区之间不能匹配，只能与另一条杂合ScFv 中相应同源v区相匹配，重新聚合成具有两个抗原结合位点的二聚体。通过分泌性原核表达体系，可直接获得有功能的双特异单链抗体分子。
 (2)共价连接制备双特异单链抗体。该方法在首先获得有功能的ScFv的基础上，根据特定研究目的，将两种具有不同抗原结合特征的ScFv用一段多肽linker直接连接起来，在原核或真核表达体系进行表达，经必要的复性或纯化过程，就可获得双特异单链抗体。该方法的关键是要选择有一定的柔韧性且不影响两端ScFv复性、结合特征的适当linker。
 (3)应用亮氨酸拉链、螺旋-转角—螺旋等蛋白质结构域连接两单链抗体制备双特异单链抗体。两个蛋白质分子通过亮氨酸残基间疏水作用形成的拉链式结构形成双体。原癌基因产物Fos利Jun是典型的带亮氨酸拉链结构的蛋白质分子，如在两个Fab的CHI末端分别剪接Jun和Fos亮氨酸拉链结构，而后匹配成以价抗体，两个不同抗体Fab段通过此连接可生成双特异性抗体。将小鼠IgC3上段铰链区和Fos或Jun亮氨酸拉链区融合于ScFv蛋白，可以建立依赖亮氨酸拉链的二聚化设计方案，可以将从噬凶体抗体筛选出的ScFv直接克隆入该系统，获得二聚化双特异单链抗体。
20、Fc段可赋予免疫黏附素的功能包括：
(1)通过与抗体或蛋白A结合用于检测或纯化；
(2)Fc段介导的抗体效应功能，如ADCC、激活补体及调理作用等：
(3)延长该蛋白在血液中的半衰期，如“CD4免疫黏附素”。
24、构建噬菌体抗体库通常包括以下几个过程：
(1)从外周血或脾、淋巴结等组织中分离B细胞，提取mRNA开反转录为cDNA；
(2)应用抗体轻链利重链引物，根据建库的需要通过PCR技术扩增不同的抗体基因片段；
(3)构建噬菌体载休；
(4)用表达载体转化细菌，构建全套抗体库。通过多轮的抗原亲和吸附(结合)-洗脱-扩增，最终筛选出抗原特异的抗体克隆。其中，噬菌体抗体库的筛选是关键环节和步骤。
32、不同类型抗体药物的开发有其自身的特殊性，但一般的开发过程可有以下几个方面。
(1)建立杂交瘤细胞株：建立杂交瘤细胞系及提供抗体开发候选药物。
(2)单抗测序：掌握单抗的DNA序列是优化抗体功能的关键，也是申请专利的关键。
(3)制备嵌合抗体：以合抗体的安全性已被美国FDA批准的上市抗体药物所证实。此外，制备嵌合抗体更符合成本效益原则。
(4)杂交瘤细胞稳定化：产生抗体的杂交瘤细胞株本质上是不稳定的。细胞系维持不当会导致产生抗体能力的丢失，并最终失去细胞株本身。因此，为了永久保存和提高抗体的生产率需要重新设计抗体。
(5)抗体人源化：抗体治疗的关键问题之一是患者的HAMA反应，抗体人源化已成为减少该反应的有力工具。
(6)确定抗体／蛋白质特性：可通过确定抗体／蛋白质特性来测定抗体和抗原的亲和力等特性和抗体的热稳定性。
(7)抗体的瞬时表达：生产足够数量的抗体以便对其进行研究。
(8)建立稳定表达抗体的细胞系：以利于生产和产品的稳定性。
(9)抗体的生产：用稳定表达抗体的细胞系来生产抗体，为研究利开发抗体生产出足量的抗体。
39、与传统筛选ASCs的方法比较，ISAAC具有下列优势。
  首先，直接有效地从原代淋巴细胞的多克隆混合物中识别利分离分泌特异性抗体的ASCs。
其次，筛选过程中可以子期分离到目标细胞，降低了使用免疫化学方法检测抗体特性过程中用于保持许多细胞克隆所需的时间和精力。
  第三，该芯片便于携带利处理，使在感染爆发现场分析针对特异性病原体的ASCs及快速应对爆发成为可能。
  第四，cDNA的5’-末端快速扩增(5'-RACE)法与ISAAC结合生产特异性抗体，不必没计5'-VH引物就能够扩增抗体cDNA。
  第五，ISAAC能够在一张芯片上检测多种抗原及挑选分泌高亲利力抗体的ASCs。
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第五章  疫苗及其制备技术
3．三次疫苗革命是：减毒活疫苗技术——第一次疫苗革命；基因更组疫苗技术——第二次疫苗革命：反向疫苗学技术——第三次疫苗革命。
8.疫苗的组成是只有免疫保护性的抗原如蛋白质、多肽、多糖或核酸等与免疫佐剂混合制备而成。
9．前用于人体的佐剂只有两种：(1)铝佐剂(氢氧化铝或磷酸铝)，是1997年之前唯一可用于人体免疫接种的佐剂；(2)MF59，是1997年由意大利首先批准上市，2005年又由美国FDA批准上市的第二个用于人体的佐剂。
12．减毒活疫苗分为细菌性活疫苗和病毒性活疫苗两大类，常用活疫苗有大花疫曲、狂犬病疫苗、卡介苗、黄热病疫苗、脊髓灰质炎疫折、腺病毒疫曲、伤寒疫苗、水痘疫苗、轮状病毒疫苗等。
17.由于DNA疫苗不需要任何化学载体，故又称为裸DNA疫曲。
21．理想的效力试验应具备以下条件：试验方法与人体使用大体相似：所用试验动物标准化；试验方法简单易行，重复性好；结果明确，能与流行病学调查结果基本一致。
23．活疫苗的效力测定又包括了活菌苗测定和活病毒滴定测定。
25．经典的血清学试验包括凝集反应、沉淀反应、中和反应利补体结合反应。
  重点及难点
4、佐剂增强免疫应答的机制是：
(1)通过改变抗原的物理形状，延长抗原在机体内保留时间：
  (2)刺激单核巨噬细胞对抗原的递呈能力：刺激淋巴细胞分化，增加扩人免疫应答的能力。
6、减毒活疫苗的作用机制最类似自然感染免疫，因而具有类似自然感染的优越性。
  减毒活疫苗的优点有：
  (1)通过自然感染途径接种，可以诱导包括体液免疫、细胞免疫和黏膜免疫在内的更全面的免疫应答，使机体获得较广泛的免疫保护。
  (2)由于使用的是活的微生物，它们可以在机体内长时间起什用而诱导较强的免疫反应，且由于活的微生物有再增殖的特性，理论上只需接种一次，即可以达到满意的免疫效果；
  (3)可能引起水平传播，扩大免疫效果，增强群体免疫屏障：
  (4)一般不需要在疫苗中添加佐剂，生产工艺一般不需要浓缩纯化，价格低廉。
  但是减毒活疫苗同时也存在—些缺点：
  (1)—般减毒活疫苗均保留一定残余毒力，对一些个体如免疫缺陷者可能诱发严重疾病，并且由于种种原因，如基因修饰等，减毒活疫苗有可能出现毒力回复，即“返祖”现象；
  (2)减毒活疫苗是活微生物制剂，可能造成环境污染而引发交叉感染等，并可能滞留在环境中形成传染源：
  (3)缺损颗粒可能干扰疫苗的免疫效果，因此产品的分析评估较为困难：
  (4)保存、运输等条件要求较高，如需冷藏等。
7、灭活疫苗具有以下特点：
(1)灭活疫苗常需多次接种：按种1剂不能产生具有保护作用的免疫，仅仅是“初始化’，免疫系统，必须接种第2剂或第3剂后才能产生保护性免疫。这样所引起的免疫反应通常是体液免疫，很少甚至不引起细胞免疫。
(2)接种灭活疫苗产生的抗体滴度随时间而下降：一些灭活疫苗需定期加强接种。灭活疫苗通常不受循环抗体影响，即使血液中有抗体存在也可以接种，它在体内不能复制，可以用于免疫缺陷者。
(3)灭沾疫苗需要量大：由于灭活疫所需要多次接种，因此需制备的量大，这给难以培养或尚不能培养的病原体带来了困难。
12、核酸疫苗以核酸形式存在，这种核酸既是载体又能在真核细胞中表达抗原。核酸疫苗的这一特性，使之与传统疫苗及基因工程疫苗等不同而被认为是一类特殊的疫苗，与传统疫苗相比具有如下优点：
 (1)免疫原性良好、效果持久及交叉免疫防护：核酸疫苗兼有重组亚单位疫苗的安全性和减毒活疫曲诱导机体产生体液免疫、细胞免疫的双重性，特别能有效地澈活CTL的杀伤活性，这对清除病毒等胞内感染病原体起着重要作用。
(2)可精细设计、便于操作、制备简便。
 (3)能制备联合疫苗，核酸疫苗的载体只有共同的理化性质，在同一载体上能携带多种病原体核酸序列，为联合疫苗研制提供了可能性。
 (4)能重复使用，质粒载体没有免疫原性，核酸疫苗接种后不会诱发针对载体的免疫反应。同一载体能运载不同的靶基因，可重复使用。
 (5)可用于免疫治疗，核酸疫苗诱导机体产生的CTL，不仅可预防病原休的感染，还可对已感染病原体的靶细胞产生免疫攻击，发挥免疫治疗作用。
15、治疗性疫苗与传统意义上的预防性疫苗有不同的特点：
(1)预防性疫苗主要作用于从未感染的机体，着眼于普遍性、安全性和有效性，天然结构的病原体蛋白可直接用作疫苗靶抗原。而治疗性疫苗的作用对象则为已经感染的病原体，天然结构的病原体蛋白一般难以诱导机体产生特异性的免疫应答，治疗性疫苗必须经过分子设计和重新构建以获得与原天然病原体蛋白结构类似的靶蛋白。
 (2)预防性疫苗的受用者是健康的人体，对已感染的患者却束手无策，而治疗性疫苗的受用对象是患者，他们往往有不同程度的免疫缺陷、免疫无能或免疫耐受，治疗性疫苗能“教会”人体免疫系统正确识别“敌人”，打破机体的免疫耐受状态。
 (3)预防性疫治接种后监测手段主要是看有无保护性抗体产生，可通过实验室进行监测，结果准确可靠。而治疗性疫苗接种后需要观察疾病是否改善，并要结合临床症状、体征、疾病相关的实验指标进行综合测试，使用时可能有一定的不良反应，伴有不同程度的免疫损伤。
 (4)激发免疫应答的类型不同。预防性疫苗接种后主要产生的是保护性抗体，即激发体液免疫反应。而治疗性疫苗主要用于防治病原体感染，病原体—旦进入宿主细胞内，抗体的作用就减弱。治疗性疫苗应是以激发细胞免疫反应为主要目的，对胞内病原体可有免疫攻击作用。此外，治疗性疫苗有时兼具预防功能。
20、疫苗制品在出厂前必须按照《中国生物制品规程》的要求对其进行严格的质量检定，以保证制品安全有效。规程中对每个制品的检定项目、检定方法利质量指标都有明确的规定，一般可分为理化检定、安全检定和效力检定三方面。
 (1)理化检定：主要是为了检测疫苗中某些有效成分和无效有害成分，包括物理性状检查、蛋白质含量测定、防腐剂含量测定、纯度检查及其他一些项目的测定。
 (2)安全性检定：疫苗制品的安全性检查主要包括三方面的内容：菌、毒种和主要原材料的检查：半成品检查，主要检查对活苗活毒的处理是否完善，半成品是否有杂菌或有害物质的污染，所加灭活剂、防腐剂是否过量等：成品检查，必须逐批按规程要求，进行无菌试验、纯毒试验、毒性试验、热原试验及安全试验等检查，以确保制品的安全性。
 (3)效力检定：疫苗的效力检定一般采用生物学方法，以生物体对待检品的生物活性反应为基础，以生物统计为工具，运用特定的试验设计，通过比较待检品与标准品在一定条件所产生的特定产物、反应剂量间的差异来测得待检品的效价。
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   第六章  酶工程制药
4.酶和其他蛋白质一样，主要由氨基酸组成，具有一、二、三和四级结构。
5．根据酶的组成成分可分为单纯酶和结合酶两类。
6.酶与一般蛋白质的差别是：酶是具有特殊催化功能的蛋白质。
14．固定化具有延长酶的半衰期、提高酶的稳定性以及可以重复使用等优点。
18.固定化细胞与固定化酶的制备原理有相似之处，也包括吸附法、包埋法、交联法。此外，还可以采用一些特殊的方法，如细胞絮凝法。
22．聚苯乙烯是世界上第一个用来担当固定化酶载体材料的合成有机高分子，它主要是通过吸附作用来固定化酶。
27．偶联率为1时，表示反应控制号，固定化或扩散限制引起的酶灭活不明显：偶联率 <l时，扩散限制对酶活力有影响：偶联率>l时，有细胞分裂或从载体排除抑制剂等原因。测定方法可以分为间歇测定利连续测定两种。
28．根据生物传感器中生物识别物质的种类可将生物传感器分为酶传感器、组织传感器、微生物传感揣、免疫传感器等，其中酶传感器是问世最早、最成熟的生物传感器。
35.影响酶反应器性能的因素很多，一般可以从以下几个方面考虑：固定化酶的形状，底物的物理性质，酶的稳定性及酶反应动力学特性等。
36．反应器的性能评价应尽可能在模拟原生产条件下进行，通过测定活性、稳定性、选择性、达到的产物产量、底物转化率等，来衡量其加工：制造质量。测定的主要参数有空时、空数、转化率、生产强度。
39．造成固定化酶活性的损失可能有下列原因：(1)酶本身的灭活；(2)酶从载体上脱落；(3)载体的破碎或溶解。
42.突变酶的应用：提高酶活性及稳定性：研究酶的功能基团。
48.交联酶晶体的生成通常分为两步：(1)酶晶体的形成；(2)使用双或多功能基团试剂如戊二醛将酶蛋白分子之间、亚基之间或分子内不同肽链部分，进行共价交联，
58．氨基酰化酶是世界上第一种工业化生产的固定化酶。氨基酰化酶的立体特异性是L-型，可对化学合成的乙酰-DL-氨基酸拆分，从而得到纯L-氨基酸。
   重点及难点
3、酶丁程包括以下个方面的研究内容：
(1)酶的分离、提纯及大批量生产：
(2)酶或细胞的固定化、酶反应器的研究：
(3)酶的分子改造与化学修饰；
(4)有机相中酶反应的研究；
(5)酶抑制剂的开发及其应用研究；
(6)模拟酶、合成酶的研究；
(7)抗体酶、核酸酶的研究：
(8)酶的定向进化技术。
5、由于酶的特殊性，在分离纯化过程中必须遵循—些原则，包括：
(1)全部操作一般在低温0～4°C进行：
(2)住分离捉纯过程中，不能剧烈搅扦：
(3)在提纯溶剂中加一些保护剂，如少量EDTA、少量9—巯基乙醇等：
(4)在分离提纯过程中要不断测定酶活力和蛋白质浓度，以对纯化过程进行监测。
10.与传统固定化酶相比，无载体酶只有以下一些优点：
  (1)催化活性高，成本低；  (2)具备较高的催化剂比表面：  (3)可加入多种酶：  (4)底物扩散受限较少；  (5)在极端条件、有机溶剂和蛋白酶中的稳定性较高。
12、固定化酶(细胞)的性质利指标。
  游离的酶经固定化后，酶本身的结构会受到影响，其催化作用由均相转到异相，由此带来的扩散限制效应、空间障碍、载体的分配效应等因素必然影响到酶的性质。
 (1)固定化后酶活力的改变：在多数情况下酶固定化后的活力比天然酶小，其专一性也会发生改变。
 (2)固定化对酶稳定性的影响：①热稳定性提高；②对有机试剂及酶抑制剂的稳定性提高； ③对pH、蛋白酶、贮存和操作条件的稳定性提高。
(3)固定化酶的最适温度变化酶反应的最适温度是酶热稳定性与反应速度的综合体现。由于固定化后，酶的热稳定性提高，所以最适温度也随之提高，这是非常有利的结果。
  (4)固定化酶的最适pH变化：酶的催化能力对外部环境特别是pH非常敏感。酶固定化后，对底物作用的最适pH和酶活力-pH曲线常常发生偏移。
 (5)固定化酶的米氏常数(Km)变化：固定化酶的表观米氏常数Km随载体的带电性能变化。
 (6)固定化酶(细胞)的指标：①固定化酶(细胞)的活力  固定化酶(细胞)的活力即是闹定化酶(细胞)催化某一特定化学反应的能力，其大小可用在一定条件下它所催化的某一反应的反应初速度来表示。②偶联率及相对活力的测定  影响酶固有性质诸因素的综合效应及固定化期间引起的酶失活，可用偶联率或相对活力来表示。 ⑧固定化酶(细胞)的半衰期，固定化酶(细胞)的半衰期是指在连续测定条件已固定化酶(细胞)的活力下降为最初活力一半所经历的连续工作时间，以t1／2表示。 ④固定化酶的热稳定性， 将固定化酶在不同温度温育1h之后，在最适温度下测酶活力，固定化酶的活力一般应保持在60％以上。

   第七章  发酵工程制药
3.生物催化剂通常是细菌、放线菌、真菌或其解体产物(如酶)和动植物细胞等。
6.我国酶制剂主要是α-淀粉酶、蛋白酶、糖化酶等。
8.抗生素是最大一类由发酵生产的微生物次级代谢产物，具有广泛的抗菌作用和抗癌、抗病毒、抗虫等生物活性，己成为发酵工业的最重要组成部分。
19．绝人多数放线菌都是革兰阳性菌，除少数外，它们都是好氧的，生长的最适温度是    28~30℃，当然嗜热放线菌例外。
30．发酵对无菌空气的要求是：无菌、无灰尘、无杂质、无水、无油、正压等几项指标。
34．在药物发酵生产中常用的碳源有糖类、脂肪、某些有机酸、醇或碳氢化合物等。
43．上游工程包括优良菌种的选育、最适发酵条件(培养基的组成、pH、温度和溶氧等)的优化等。
45．下游工程是指发酵液中产品的分离纯化与鉴定，副产物的回收，废物处理等。
48．每批发酵的全过程包括空罐灭菌、培养基的灭苗、接种、发酵、放罐利洗罐等，所用的时间总和为一个发酵周期。
53．发酵液中产物的积累通常以发酵单位表示。
59．乳糖是青霉素合成的最好碳源。
63．补料最人的量为使放罐时发酵液体积达到排有效体积的80％～90％。
89．青霉素属β-内酰胺类抗生素，其主要作用机制是干扰细菌细胞壁的合成。
93．多糖类一般不溶于水，无甜味，不能形成结晶，无还原性和变旋现象。
   重点及难点
4、理想的工业发酵菌种应符合的要求包括：
 (1)遗传性状稳定：(2)生长速度快，不易污染；(3)目标产物产量尽可能接近理论转化率；（4)目标产物最好分泌到胞外；(5)尽可能减少类似物的产量；(6)其所利用生长的培养基成分简单、价格低廉。
11、半连续培养的缺陷：
  首先放掉发酵液的同时会损失未被利用的营养物质和正处于代谢活跃状态的菌体细胞：其次中间补料会造成发酵液稀释，增加下游提取液的体积：
再次，发酵液中一些由代谢产生的前体有可能会丢失，造成发酵产物产量的影响。此外，半连续发酵过程中的染菌问题也是影响发酵过程能否进行的重要因素。
12、连续发酵存在的问题：
(1)由于是开放体系，加上发酵周期长，容易污染杂菌：
(2)朴长周期连续发酵中，微生物易发生变异：
(3)对设备、仪器及控制元件的技术要求较高：
(4)黏性丝状菌菌体容易附着在器壁上生长或发酵液内结团，带来操作困难。
总之，连续发酵营养物利用率低于单批培养，一般只能维持数月至1年。
13、通过显微镜观察菌丝形态在发酵中也是—个重要的分析项目：
(1)观察种子阶段菌丝生长情况，掌握最适种龄，确保优质种子：
(2)观察发酵阶段菌丝生长情况，为选择合适的发酵条件；提供依据；
(3)及时发现不正常生长的菌丝，设法采取补救措施；
(4)及时发现杂菌污染，及早控制和处理。
15、在发酵过程中，pH对微生物生长繁殖和产物合成的影响表现在：
(1)pH影响酶的活性，当pH值抑制曲体某些酶的活性时使菌的新陈代谢受阻：
(2)pH影响微生物细胞膜所带电荷的改变，从而改变细胞膜的透性，影响微生物对营养物质的吸收及代谢物的排泄，因此影响新陈代谢的进行；
(3)pH影响培养基某些成分和中间代谢物的解离，从而影响微生物对这些物质的利用。
(4)pH影响代谢方向，pH不同，往往引起菌体代谢过程不同，使代谢产物的质量和比例发生改变。
16、发酵过程中，常见的引起溶解氧异常下降的原因有：
(1)污染好气性杂菌，大量的溶解氧被消耗掉：
(2)菌体代谢发生异常现象，需氧要求增加，使溶解氧下降：
(3)某些设备或工艺控制发生故障或变化，也可能引起溶解氧下降；
(4)其他影响供氧的工艺操作。
18、过多的泡沫会给发酵带来负面影响，主要表现在：
(1)在发酵罐中，为了容纳泡沫、防止溢出而降低装液系数(大多数发酵罐的装液系数为0．6～0．7)，从而降低生产能力：
(2)大量气泡引起“逃液”，造成原料和产物的损失：
(3)如果气泡稳定、不破碎，那么随着微生物的呼吸，气泡中充满二氧化碳，而且又不能与空气中氧进行交换，这样就影响了菌的呼吸；
(4)泡沫液位的上下变动，使部分菌体黏附在罐顶或罐壁上，使发酵液中菌体量减少；
(5)泡沫升至罐顶，顶至轴封或逃液，增加染菌机会：
(6)消泡剂的加入会给提取工艺带来困难。
21、考虑到生物安全性及产品的高附加值，对用于基因工程菌的发酵罐有如下要求：
(1)密封性能好，以防止染菌及泄漏：
(2)自动化程度高，减少基因工程菌与人的接触；
(3)发酵过程中的排气要经过特殊处理，以保证基因工程菌不泄漏。发酵结束后要经灭菌处理才能放罐。
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   第八章  微生物转化
   11．甾体微生物转化反应主要类别有羟化反应、氧化反应、脱氢反应、甾体边链降解等。
    重点及难点
2、生物转化反应常具有优点包括：
(1)可在常温、常压和中性条件下进行高效酶催化反应，无需有机合成中常见的高温、高压及复杂的工艺，有利于改善劳动条件、简化设备和降低成本等：
(2)由于酶反应具有专一性，可以以复杂粗组分为原料进行反应。
(3)酶反应可以用简单的酸碱、温度或金属离子等加以调节，在生产上容易调节控制：
(4)酶本身无毒无臭无味，可用于食品工业和医药工业中：
(5)随着酶和细胞闹定化等酶工程技术的发展，可将微生物细胞或酶包埋或固定在大分子载体上，使反应连续化：
(6)微生物繁殖快，酶种类多，并可通过分子变异提高酶的活力，对发展微生物转化工业提供了十分有利的条件：
(7)许多化学方法难以进行的反应，可以通过一步或多步微生物转化完成。
4、目前一般采用以下三种方法避免微生物对甾体母核的降解。
(1)对固醇进行结构改造达到选择性降解甾体边链的目的。
(2)在酶抑制剂存在下对甾体进行选择性边链降解。
(3)应用诱变或分子生物子技术筛选或构建选择性降解甾体边链的菌株。
7、微生物转化技术进行中药研究的意义。
(1)保护中药活性成分免遭破坏：与传统中药提取工艺煎、煮、熬、炼、蒸、浸等相比，微生物是在常温、常压等较为温和的条件下进行生物转化，故能最大限度地保护中药中活性成分免遭破坏，特别是对温度敏感的芳香类挥发油、维生素等活性成分更能有效地加以保护。
(2)可对中药活性成分进行结构修饰：通过对中药中有效成分进行修饰，可以获得更有效的成分以提高治疗效果。
(3)能帮助对中药吸收机制的认识：中药化学成分多种多样，当作为药物应用时，必须在消化道中与肠道菌接触。一些中药成分可以直接被人体吸收，但有—些则必须通过人体消化酶或肠道菌代谢才能吸收。通过研究肠道菌对中药的转化作用，能开发出可被人体直接利用的重要制剂，提高中药的使用价值。
(4)有利于产生新的天然化合物库：以多种不同催化功能的酶系对中的化学成分进行转化可产生新的天然化合物库，结合高效快速的药物筛选手段，能发现新的先导化合物。
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第九章  蛋白质药物的化学修饰
   1．1990年第一个化学修饰蛋白质药物--PEG修饰的腺苷脱氨酶(PEG-ADA)上市。
4．从大的方面讲，修饰策略分为随机修饰利定点修饰两种。
10．G修饰后蛋白质的生物活性、免疫原性、稳定性利生物半衰期与PEG的Mr大小和修饰类别有关。一般PEG的Mr越大，修饰蛋白的活性损失越大、免疫原性越低、稳定性越高、生物半衰期越长，因此Mr选择要综合考虑修饰蛋白的生物活性、免疫原性、稳定性和生物半衰期等多方面的因素。
13．选择PEG修饰剂要考虑的因素有PEG的Mr修饰位点、水解稳定性和反应活性、还需要考虑需要的修饰度、修饰剂与蛋白质的连接键的稳定性、修饰后蛋白质的构象变化及修饰后的分离纯化等。
   重点及难点
2、蛋白质药物化学修饰能赋予蛋白质药物多种优良性能，具体表现为：
(1)循环半衰期延长；(2)免疫原性降低或消失，毒副作用减小：(3)物理、化学和生物稳定性增强等。
3、蛋白质药物化学修饰能赋予蛋白质药物多种优良性能，这在很人程度上扩宽了蛋白质药物的应用范围。其原因可能为：
(1)蛋白质经化学修饰后，相对分子质量(Mr)增大，当Mr达到或超出肾小球滤过阈值时，化学修饰的蛋白质随血液循环进入肾脏后就可以逃避肾小球的滤过作用：同时，由于修饰剂的屏蔽效应，使得修饰后的蛋白质或多肽不易受到仟种蛋白酶的攻击，降解速率明显降低，稳定性提高，可以在血液循环中停留更长的时间：
 (2)修饰剂能掩盖蛋白质表而的抗原决定簇，使得蛋白质不能与各种细胞表面受体结合，不被机体的免疫系统识别，避免了相应抗体的产生，降低了蛋白质的免疫原性；
 (3)修饰剂与蛋白质偶联后能赋予其优良的理化性质，因而改善蛋白质的生物分布和溶解性能。
4、一般来说，选择蛋白质修饰剂需要考虑的问题有：
(1)修饰剂的毒性、抗原性及稳定性；(2)修饰剂的反应活性及对修饰位点的选择性；(3)修饰剂与蛋白质连接键的稳定性：(4)修饰剂对蛋白质构象及生物活性的影响；(5)是否适合于建立快速、方便的分析、分离及纯化方法：(6)修饰剂是否价廉易得等。
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   第十章  新型生物技术制药
   6．反义核酸药物福米韦生经过美国FDA批准上市，成为第1个反义核酸药物，由21个硫代脱氧核首酸组成，核甘酸序列为：
5’—GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCG-3’，主要用于治疗艾滋病患者并发的巨细胞病毒性视网膜炎。
7．基因治疗的关键是将目标基因导入机体并保证导入的基因能正确表达所需的蛋白质。
17．T细胞是胸腺依赖淋巴细胞的简称，是在胸腺内成熟的淋巴细胞，根据功能可以将T细胞分为辅助性T细胞(Th)和细胞毒性T细胞(Tc)两人类。
18．Th细胞表面带有标记分子CD4+，能识别抗原，分泌多种淋巴因子，其主要功能是调节免疫系统的功能，增强免疫能力。Tc细胞是效应T细胞，表面带有标记分子 CD8+，在抗原刺激下大量增殖，并与靶细胞结合，发挥杀伤靶细胞的功能。Tc细胞是抗病毒感染及抗肿瘤的主要效应细胞。
22．具有抗原呈递功能的细胞有很多类，包括巨噬细胞、树突状细胞(DC)、微皱褶细胞(M细胞)、B淋巴细胞等等。它们广泛分布于人体与外界接触的部位及淋巴组织内。其中以DC的抗原呈递功能最强，也最为重要。
24．最原始的干细胞是早期胚胎中的细胞，称为胚胎干细胞，受精卵分裂初期的早期胚胎干细胞是全能干细胞，可以分化成各种类型的细胞；囊胚期及以后的胚胎细胞是多能干细胞，可以分化成人多数类型的细胞。
   重点及难点
1、反义核酸降低基因表达的作用机制并不是很清楚。实验发现它的作用方式可能有：
(1)与前体RNA结合，影响其形成正确的二级结构，从而干扰它剪接加工成成熟的mRNA：
(2)与mRNA结合，封闭核糖体结合到mRNA上的位点，或抑制核糖体沿mRNA扫描，从而影响转译的进行；
(3)与mRNA分子形成双链RNA，诱导RNaseH(核糖核酸酶H)降解mRNA：
(4)与细胞基因组DNA的相应序列结合，影响DNA复制等。
3、核酸药物的修饰
  主要的修饰方式有以下几种：
 (1)修饰磷酸二酯键：如用硫原子替代磷酸基团中的一个氧原子，即硫代磷酸盐寡核苷酸。这类分子合成容易、稳定性好，同时在水中的溶解度高，易于被细胞吸收，也能促进RNase H对目标RNA的切割作用。但其主要缺点是对靶RNA分子的亲和性较低。
 (2)修饰核糖：最常用的是戊糖2’-O羟甲基等修饰的RNA。这类修饰的核酸不易被核酸酶降解，同时，能够和目标mRNA发生高亲和性和特异性的配对结合。
 (3)修饰骨架：肽核酸是用多肽键来代替天然核酸的磷酸—戊糖骨架，同时保留碱基结构的寡聚苷酸类似结构。这种肽核酸保持了与DNA或RNA发生高亲和性和特异性结合的能力，对各种核酸内切酶、外切酶利蛋白酶都有很强的抗性。

上一条：吉林大学自考本科细胞生物学复习资料 02085
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